مقاله درمورد دانلود هورمون رشد، نمونه برداری، رنگین کمان، کشاورزی و منابع طبیعی

2-9-1 بافر RCR
این بافر معمولا شامل Tris با 8/8-3/8 pH = و یک نمک مثل کلرید پتاسیم (KCl) یا سولفات آمونیوم می‌باشد. این بافر می‌تواند حاوی افزودنی‌هایی مانند Tween 20، Triton X-100، DMSO (دی متیل سولفوکساید) و ژلاتین باشد که کارایی RCP را افزایش می‌دهند (فرسون و همکاران، 2000 ). این بافر معمولا به صورت 10x تهیه و همراه با آنزیم نک پلیمراز ارائه می‌گردد. غلظت مناسب آن در واکنش معمولا 1X می‌باشد. KCl به اتصال آغازگر به DNA الگو کمک می‌کند اگرچه در غلظت‌های بالا این عمل ممکن است بیش از حد مطلوب گردد و باعث پایداری اتصال غیر اختصاصی آغازگر به DNA الگو و ایجاد محصولات ناخواسته شود (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2)
از اجزا به سیر مهم PCR است و غلظت بهینه آن در کارایی واکنش نقش مهمی دارد. با افزایش غلظت یون منیزیم (Mg+2) قدرت اتصال آغازگرها افزایش می‌یابد و به دمای اتصال بالاتری نیاز است و احتمال تشکیل پرایمر-دایمر اقزایش می‌یابد و این امر موجب اتصال آغازگرها به صورت دوتایی با یکدیگر یا به صورت حلقوی با خودشان شده و در اثر تکثیر غیر اختصاصی آن‌ها، تجمعی از قطعات کوچک به وجود می‌آید. مقداری از آغازگرها نیز بدین ترتیب از واکنش خارج می‌شوند. افزایش غلظت یون منیزیم موجب افزایش دمای مرحله واسرشته سازی و افزایش فعالیت پلیمرازی آنزیم تک پلیمراز (این آنزیم برای فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد Mg+ نیاز دارد) می‌شود. همچنین یون منیزیم با نوکلئوتیدها ترکیب می‌شود و کمپلکس محلولی را به وجود می‌آورد که برای ورود و جایگزین شدن آن‌ها در زنجیره DNA بسیار لازم است. در صورتی که در غلظت‌های بسیار پایین بازده واکنش کم خواهد شد. غلظت منیزیوم آزاد تحت تاثیر غلظت dNTP ها، پیروفسفات آزاد (PPi) و EDTA می‌باشد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)
نوکلئوتیدها واحدهای سازنده DNA هستند و از مواد مهم مورد نیاز واکنش PCR می‌باشند. آنزیم‌های DNA پلیمراز ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز می‌کنند. در واکنش PCR نیز همانند سنتز طبیعی DNA از چهار نوع نوکلئوتید به فرم دی اکسی (dTTP، dGTP، dCTP، dATP) استفاده می‌شود. این نوکلئوتیدها معمولا به طور جداگانه یا مخلوط به صورت تجاری در دسترس هستند. باید از غلظت برابر نوکلئوتیدها استفاده شود در غیر این صورت اشتباه جایگزینی40 رخ می‌دهد و ممکن است باعث تفاوت توالی فرآورده PCR با توالی الگو شود. کیفیت و مقدار dNTP مورد استفاده در کارایی و اختصاصی بودن PCR موثر است. چنانچه مقدار dNTP بیشتر از نیاز واکنش باشد امکان تشکیل نقاط آغازین اشتباه41 و تشکیل قطعات غیر اختصاصی وجود دارد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-4 آنزیم تک پلیمراز42
این آنزیم به شکل طبیعی یا نوترکیب تولید می‌شود و از سایر انواع DNA پلیمرازها معروف‌تر است و بیشتر از آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم با شناسایی انتهای آزاد هیدروکسیل ‘3 آغازگر، نوکلئوتیدها را به ترتیب ارائه شده از روی زنجیره مکمل به آن متصل می‌کنند و یک رشته DNA مکمل رشته الگو می‌سازد. سرعت اتصال نوکلئوتیدها و حرکت آنزیم پلیمراز در انواع مختلف این آنزیم متفاوت بوده و بین 5 الی 80 نوکلئوتید در ثانیه می‌باشد. اگر غلظت آنزیم زیاد باشد قطعات غیراختصاصی در فراورده PCR دیده خواهد شد که گاهی به صورت کشیدگی مشاهده می‌شود و در صورتی که مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد، فرآورده مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی‌شود و به ویژه در موارد تشخیصی نتایج منفی کاذب را به وجود می‌آورد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-5 آغازگرها
در طی واکنش PCR، آغازگرها به دو طرف توالی هدف اتصال یافته و امکان آغاز فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌آورند. مهم‌ترین ویژگی آغازگر، توالی صحیح آن برای مکان مورد تکثیر می‌باشد. با در اختیار داشتن توالی هدف امکان تعیین توالی آغازگرها به وجود می‌آید. طول آغازگر نیز مهم است و طول مناسب از اتصال آغازگر به مناطق غیر هدف می‌کاهد. طویل بودن پرایمر (پرایمرهای با بیش از 30 جفت باز) امکان اتصال آن‌ها به خود و به یکدیگر را تشدید می‌کند و زمان اتصال را نیز افزایش می‌دهد. در طراحی آغازگرها نکات متعددی مانند طول آغازگر، ترکیب نوکلئوتیدی (محتوای GC)، دمای ذوب43 (Tm) و غیره را باید در نظر داشت (فرسون و همکاران، 2000 ). برای طراحی آغازگرها نرم افزارهای متعددی وجود دارد که می‌توان به DNA MAN، DNASIS و Oligo tech اشاره نمود.
2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) )
این روش در سال 1989 ابداع شد. در الکتروفورز SSCP، ابتدا از یک ماده واسرشته ساز مانند اوره استفاده می‌شود تا DNA ی دو رشته به DNA ی تک رشته‌ای تبدیل شود. به هنگام راندن DNA ی تک رشته‌ای روی ژل اثرات متقابل درون مولکولی روی می‌دهد. به عبارت دیگر بین بخش‌هایی از این DNA پیوند ایجاد می‌شود و ساختمان ثانویه‌ای تشکیل می‌دهد. بنابراین حرکت مولکول‌های DNA در این حالت به جای اینکه تابع اندازه مولکول باشد به ساختمان ثانویه DNA ی تک رشته‌ای بستگی دارد. در طی الکتروفورز، این ساختمان‌ها که به توالی رشته مورد نظر بستگی دارد به وسیله برودت حفظ می‌شود. اگر در این توالی جهشی رخ داده باشد، نوع پیوندهایی که تشکیل می‌شوند متفاوت بوده و باند مربوطه روی ژل نیز متفاوت خواهد بود. د ر صورتی که چند شکلی در قسمت ابتدائی محصول PCR باشد، تشخیص آن از طریق SSCP آسان‌تر است. عواملی مثل دمای ژل (نباید بالا باشد)، درصد ژل اکریل آمید (5 تا 6 درصد مناسب است) و اندازه قطعه DNA مورد بررسی (معمولا بین 100 تا 250 جفت باز و ایده آل 155 جفت باز) در موفقیت SSCP نقش دارد (رضوانی، 1997).
2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده:
طبق مطالعات انجام شده مشخص شد که ساختار ژن هورمون رشد در بین ماهیان استخوانی یکسان نیست. به طور مثال، در کپور ماهیان همانند پستانداران، این ژن دارای پنج اگزون و چهار اینترون است اما در دیگر ماهیان متفاوت بوده و دارای یک اگزون اضافی است (اهکوبو و همکاران، 1996). جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد بوده است. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصات فنوتیپی برای مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعاتی محدود نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999).
طبق پژوهش‌های گروس و نیلسون (1999) تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان44 مورد بررسی قرار گرفت. تعداد نمونه‌های مورد بررسی در این پژوهش 579 ماهی از 22 جمعیت مختلف بود که از شمال اروپا تهیه و به روش PCR-RFLP 45 و با استفاده از 10 نوع آنزیم تنوع این ژن مورد مطالعه قرار گرفت که سه نوع هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد.
اندازه‌های چهار اگزون در طول دوره تکامل بدون تغییر باقی مانده‌اند به جز اگزون 5 که به دو قسمت تبدیل شده است به طوری که دو نوع ساختار ژن هورمون رشد را در ماهیان استخوانی به وجود آورده است. برای مثال، خانواده کپور ماهیان دارای پنج اگزون و گونه‌های دیگر همانند آزاد ماهیان و سوف ماهیان دارای شش اگزون می‌باشند (آلمولی و همکاران، 2000). در ضمن، در ماهیان دو نوع متفاوت از ژن هورمون رشد شامل GH-1 و GH-2 برای مثال در ماهیانی نظیر آزاد اطلس46 نیز گزارش شده است (تائو و بولدینگ، 2003).
این ژن به صورت موفقیت آمیزی در گونه سیم دریایی47 (کالدوچ گینر و همکاران، 2003) و ماهی تیلاپیا48 (کاجیمورا و همکاران، 2004) و چندین گونه دیگر کلون شده است. ولی در خصوص چندشکلی این ژن و ارتباط آن با میزان رشد در ماهیان گزارشی مشاهده نشده است. در حیوانات دیگر پژوهش‌های زیادی به عمل آمده است که ارتباط بسیار زیاد این ژن با میزان رشد فنوتیپی را نشان می‌دهد.
پریمر و رینانن (2004) در پژوهشی تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان را به روش PCR-RFLP بررسی و SNP 49 را شناسایی کردند. از تعداد 9 جمعیت مختلف شامل 2 جمعیت از شمال آمریکا و 7 جمعیت در اروپا نمونه برداری شده بود. چند شکلی مشاهده شده در مناطق بالا دست و پایین دست ژن هورمون رشد، اینترون 3 و اینترون 4 نشان دهنده اختلاف بین جمعیت‌های آمریکای شمالی و اروپا بود.
مو و همکاران (2004) در هفت جمعیت کپور وحشی، هفت نوع الگو (A، B، C، D، E، F و G) در ناحیه اینترون 2 ژن GH-1 به روش PCR-SSCP شناسایی کردند که طول آن‌ها به ترتیب 189، 196، 204، 205، 206، 207 و bp 209 بود.
کوخر و کهلمن (2011) چندشکلی‌های ژن هورمون رشد در لای ماهی50 از خانواده کپور ماهیان را بررسی کردند. پژوهش‌های آن‌ها نشان داد این ماهی مانند همه کپور ماهیان دارای چهار اینترون و پنج اگزون می‌باشد و با دو روش PCR-RFLP و تعیین توالی، اختلاف موجود در ساختار ژنتیکی ژن هورمون رشد در تعداد 17 نمونه از دو جمعیت مختلف مورد بررسی قرار دادند. از 14 چندشکلی مشاهده شده از 12 جایگاه در منطقه اینترون و 2 جایگاه در منطقه اگزون، در مجموع 13 هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد که کل جمعیت را به دو کلاس اروپای شرقی و اروپای غربی تقسیم نمود.
نی و همکاران (2012) در یک جمعیت از ماهی کراکر زرد51، نتایج PCR-SSCP دو هاپلوتیپ از اینترون 1 را به نام ژنوتیپ های AA و AB نشان دادند. در AB، یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در موقعیت 196 (G→A) مشاهده شد که با وزن بدن همبستگی منفی و با طول/ ارتفاع استاندارد بدن همبستگی مثبت داشت. در جمعیت دیگر، دو ژنوتیپ مختلف CC و CD در اینترون 2 شناسایی شدند که در CD یک SNP در موقعیت 692 (T→C) مشخص شد. ژنوتیپ CD همبستگی مثبت قابل توجهی با وزن کل و طول بدن داشت.
تیان و همکاران (2014) چندشکلی ژن GH و ارتباط آن با صفات رشد را در 282 نمونه ماهی سوف چینی52 مورد بررسی قرار دادند. با استفاده از توالی‌یابی، چهار SNP در ژن GH شناسایی شد که دو جهش در اینترون 4، یک جهش در اگزون 5 و یک جهش در اینترون 5 رخ داده بود که سه جهش از آن‌ها ارتباط مثبت معنی داری را با رشد نشان دادند. فصل سوم مواد و روش‌ها
3-1 نمونه برداری
نمونه برداری از 150 قطعه ماهی سفید از کارگاه شهید رجایی و 150 قطعه ماهی کپور معمولی از کارگاه پرورش ماهی نصر ساری انجام شد. ماهی سفید از دوره هچری به سالن تکثیر منتقل و تا 3 ماهگی نگهداری شدند. سپس از آن‌ها نمونه گیری شد و تمامی آن‌ها در سن 3 ماهگی بودند ولی در ماهی کپور 84 قطعه از آن‌ها در سن 4 ماهگی، 54 قطعه در سن 12 ماهگی، 5 قطعه ماهی در سن 24 ماهگی و 7 قطعه ماهی در سن 6 ماهگی بودند. نمونه گیری به میزان 3-2 گرم از بافت باله دمی ماهی سفید و کپور معمولی انجام شد. نمونه‌های باله دمی در الکل 96 درصد فیکس شده و سپس تا زمان استخراج DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نمونه‌های جمع آوری شده به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شده و DNA ژنومی استخرا ج گردید.
3-2 بررسی فاکتور وضعیت53
یکی از شاخص‌های رشد فاکتور وضعیت است که ضریب چاقی نیز نامیده می‌شود. برای به دست آوردن آن طول کل که فاصله پوزه تا انتهای باله دمی است؛ بر حسب سانتی متر اندازه گیری شد. وزن ماهی نیز به وسیله ترازو دیجیتالی بر حسب گرم اندازه گیری شد. فاکتور وضعیت یا ضریب چاقی برابر است با:
CF= W/L3 *100
W: وزن و L: طول بدن می‌باشد.
3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته
استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته (میلر و همکاران، 1988) انجام شد. قبل از شروع استخراج تمام بافرها تهیه و مواد و وسایل مورد نیاز برای استخراج آماده و جهت ضدعفونی اتوکلاو شد.
3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA
برای تهیه بافر STE 7/0 گرم تریس، 2/0 گرم نمک 07/0 مولار را با cc50 آب مقطر حل کرده، سپس 100 میکرولیتر محلول EDTA 5/0 مولار به آن اضافه می‌شود. برای تهیه EDTA 5/0 مولار، 3/9 گرم پودر EDTA را با cc50 آب مقطر حل کرده و pH آن به 8 می‌رسد، برای تنظیم pH از دستگاه pH متر، برای کاهش pH از HCl و برای افزایش pH از NaoH استفاده می‌شود. برای تهیه SDS و استات آمونیوم 10% بایستی به نسبت 1 به 10 پودر آن با آب مقطر حل شود. برای تهیه استات سدیم 3 مولار، بایستی 3/12 گرم پودر آن با cc 50 آب حل شود.
سی میلی گرم از باله را جدا کرده و در محیط بیرون قرار داده تا الکل آن تبخیر شود، سپس آن را خرد نموده و در تیوپ‌های 5/1 میلی لیتری ریخته و به آن 500 میکرولیتر بافر STE برای انفجار سلولی، 50 میکرولیتر بافر SDS 10% برای هضم چربی‌های موجود در بافت و 6-5 میکرولیتر پروتئیناز K برای هضم پروتئین‌ها اضافه شد. سپس نمونه‌ها را به خوبی ورتکس کرده و به مدت یک ساعت روی دستگاه شیکر با سرعت 90 قرار داده تا این مواد به طور کامل با هم مخلوط گردد و در نهایت به مدت 16 ساعت در بن ماری با دمای 58 درجه سانتی گراد گذاشته تا بافرها بهتر عمل کرده و عمل لیز شدن و هضم آنزیمی به خوبی انجام شود. پس از بیرون آوردن آن‌ها از بن ماری 160 میکرولیتر استات آمونیوم 10% به نمونه‌ها اضافه نموده و به مدت یک ساعت روی شیکر با سرعت 90 قرار داده شد تا خوب مخلوط شود و بعد به مدت 10 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. پس از پایان سانتریفیوژ دو فاز درون تیوپ تشکیل می‌شود، فاز زیرین حاوی بافت خرد شده باله و چربی و پروتئین بافت است و فاز بالایی حاوی DNA می‌باشد. به آرامی فاز بالایی را جدا کرده و درون تیوپ‌های جدید ریخته شد. به مایع درون تیوپ‌های جدید 600 میکرولیتر الکل ایزوپروپانول یا الکل مطلق سرد و 30 میکرولیتر استات سدیم اضافه شده (در این حالت کلاف شفافی در تیوپ قابل مشاهده است که همان DNA می‌باشد). سپس نمونه‌ها به مدت 40-30 دقیقه در یخچال C°20- نگهداری شده، بعد به مدت چند دقیقه از یخچال بیرون آورده تا یخ آن آب شود. نمونه‌ها را به مدت 15 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ کرده، سپس محلول را دور ریخته و تیوپ حاوی DNA را با 100 میکرولیتر الکل 70% شستشو داده و به مدت 2 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. مجددا محلول رویی را دور ریخته و تیوپ‌ها در دمای آزمایشگاه کاملا خشک شده]]>

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *