100 از محلول TMB substrate به تمامی حفرات اضافه میکنیم و در دمای اتاق (oc25-18) به مدت 30-20 دقیقه انکوباسیون می کنیم (از تابش هر نوری به پلیت جلوگیری شود).
اضافه کردن محلول متوقف کننده را زمانی انجام میدهیم که غلیظ ترین استاندارد به رنگ آبی تیره در این زمان محلول متوقف کننده را سریع به تمام حفرات اضافهمیکنیم و بلافاصله جذب نوری محلولها توسط دستگاه خواننده الیزا با طول موج 450 نانومتر خوانده میشود.
برای محاسبه نتایج: میانگین جذب نوری دوگانه را برای نمونهها و استاندارد محاسبه میکنیم. منحنی استاندارد با استفاده از میانگین جذب نوری استاندارد و غلظتهای- TNFاستاندارد رسم میشود. غلظت- TNFتهیه نمونهها بر اساس منحنی استاندارد محاسبه میگردد. 5-2-3- IFN γ
روش اندازهگیری IFN γ با استفاده از کیت میباشد. 1-5-2-3- اساس روش کار
درون گودهها توسط آنتی بادی علیه INF-γ، پوشیده شده است. INF-γ که در نمونهها یا استاندارد وجود دارد با آنتی بادیهای پوشیده شده در گودهها باند میشوند. بیوتین کونژوگه علیه INF-γ اضافه میشود و به INF-γ متصل شده به آنتی بادی اولیه، باند میشود. بعد از انکوباسیون بیوتین کونژوگههای باند نشده از طریق شستشو خارج میشود سپس هورس رادیش پراکسیداز متصل به استرپتاویدین را اضافه کرده که به بیوتین کونژوگههای باند شده متصل می شوند دوباره انکوباسیون را انجام داده و هورس رادیش پراکسیداز متصل به استرپتاویدینهای باند نشده از طریق شستشو خارج میشوند. سپس محلول سوبسترا اضافه میشود. رنگ ایجاد شده بستگی به مقدار INF-γ در نمونهها و استاندارد دارد واکنش از طریق افزودن اسید (Stopsolution) خاتمه یافته و جذب نوری در nm450 خوانده میشود.
2-5-2-3- محتویات کیت
حفرات پوشیده شده با آنتی بادی علیهINF-γ ، بیوتین کونژوگه مونوکلونال علیهINF-γهورس رادیش پراکسیداز متصل به استرپتاویدین و محلول رقیق کننده ، INF-γ استاندارد لیوفیلیزه(1000pg/ml)، محلول رقیق کننده استاندارد INF-γ ، بافر شستشو (200x)، محلول سوبسترا ، محلول متوقف کننده واکنش(اسید سولفوریک)
وسایل موردنیاز:
پیپت مدرجml5، ml10، میکروپیپت تک کاناله متغیر 5 تا 1000، میکروپیپت چندکاناله متغیر 50 تا 300، فلاسک، سیلندر، ظرف آزمایشگاهی مناسب جهت آماده سازی معرفها، سیستم اتوماتیک شستشو یا بطری چند کاناله شستشو، کاغذ خشک کن،‌آب مقطر، دستگاه خواننده الیزا با طول موج 450 نانومتر.
محتویات کیت تا زمانی که در دمای oc8-2 نگهداری شوند سالم باقی میماند. از نمونههای همولیز شده و لیپمیک (lipemic) نباید استفاده شود. نمونهها باید به صورت در بسته و فریز شده در دمای oc20- نگهداری شوند. قبل از شروع تست، نمونههای فریز شده باید در دمای اتاق به آرامی ذوب شوند و به ملایمت مخلوط گردند.
3-5-2-3- آماده سازی محلولهای مورد نیاز
Wash buffer (1x):
مقدار ml50 از بافر شستشو (20x) را با ml950 آب مقطر مخلوط میشود (به آرامی تا کف ایجاد نشود)‌. این محلول در دمای oc25-2 به مدت 30 روز قابل نگهداری است.
– (1x) Standard buffer:
مقدار ml 10از این بافر را با ml90 آب مقطر مخلوط میکنیم.
– Biotin- conjugate:
ماده ذکر شده به نسبت با Assay buffer (1x) رقیق میشود. این محلول فقط تا 30 دقیقه بعد از رقیق سازی قابل استفاده است.
– Streptavidin- HRP :
ماده ذکر شده را به نسبت با Assay buffer (1x) رقیق میشود. این محلول فقط تا 30 دقیقه بعد از رقیق سازی قابل استفاده است.
– IFN-γ استاندارد:
با افزودن آب مقطر به پودر لیوفیلیزه IFN-γ تهیه میشود غلظت محلول بدست آمده
pg/ml 2000 است.
رقیق سازی استاندارد: بصورت مستقیم درون پلیت و یا بصورت غیر مستقیم در تیوپ تهیه می شود.
روش داخل پلیت: جهت تهیه 7 رقت استاندارد نیاز به 14 گوده است زیرا بصورت دوتایی کارمیشود. مقدار 100 از رقیق کننده نمونه در تمامی گودهها ریخته میشود. سپس 100 از محلول استاندارد IFN-γ تهیه شده به اولین گودهها (A1, A2) اضافه کرده و بعد از مخلوط کردن،‌100 از آن را برداشته در گودههای دوم (B1, B2) میریزیم. این کار را برای گودههای بعد هم انجام میدهیم و در نهایت 100 از خانه 7 (G1, G2) دور ریخته میشود. خانههای H1 و H2 به عنوان شاهد (Blank) بوده که فقط حاوی 100 از رقیق کننده نمونه است.
4-5-2-3- روش کار
همه نمونهها، شاهد و نمونه کنترل باید به صورت دوتایی تست شوند.
100 از رقیق کننده نمونه در خانههای شاهد ریخته میشود.
100 از هر نمونه به گودهی مربوط به آنها اضافه میشود.
بیوتین کونژوگه را طبق دستور گفته شده آماده میگردد.
50 از بیوتین کونژوگه را به تمامی گودهها اضافه میشود.
پلیت را در پوشش خاص خود گذاشته و در دمای (oc25-18) به مدت3 ساعت آنکوباسیون میشود.
آماده سازی Streptavidin-HRP طبق الگوی گفته شده انجام میشود.
بعد از گذشت 3 ساعت، پلیت را از پوشش خود خارج کرده و حفرات را 3 مرتبه با محلول شستشوی رقیق شده Wash buffer (1x) شستشو دهید سپس آنرا روی کاغذ خشک کن کوبیده بطوریکه رطوبت اضافی خارج شود ولی پلیت خشک نشود.
100 از Streptavidin- HRP رقیق شده به تمامی خانه ها اضافه میشود.
پلیت را در پوشش خود گذاشته و به مدت 20دقیقه در دمای (oc25-18) انکوباسیون میگردد.
بعد از گذشت زمان موردنظر، پوشش را خارج کرده و گودهها را 3 مرتبه با محلول شستشوی رقیق شده، شسته میشود. سپس آنرا روی کاغذ خشککن کوبیده بطوریکه رطوبت اضافی خارج شود ولی پلیت خشک نشود.
100 از محلول TMB substrate به تمامی خانهها اضافه میشود و به مدت 15-12 دقیقه در دمای اتاق (oc25-18) انکوباسیون میگردد (از تابش هر گونه نور به پلیت جلوگیری کنید).
زمانی محلول متوقف کننده واکنش را اضافه میشود که غلیظ ترین استاندارد به رنگ آبی تیره برسد. در این زمان محلول متوقف کننده واکنش به تمامی گودهها اضافه میگردد و جذب نوری محلولها توسط دستگاه خواننده الیزا با طول موج 450 نانومتر خوانده میشود.
منحنی استاندارد را با استفاده از میانگین جذب نوری استاندارد و غلظتهای استاندارد رسم می شود. غلظت نمونهها را براساس منحنی استاندارد محاسبه میگردد. 6-2-3- اینترلوکین -1 بتا
IL-1-β توسط کیت الیزای گوسفندی به نام GSI Ovine IL-1- beta ELISA Kit اندازهگیری شد. این کیت متعلق به شرکت Genorise Scientific, Inc.paoli با شماره PA19301 میباشد که ساخت کشور آمریکا است.
این کیتهای الیزایی که برای تشخیص این سیتوکین به کار میرود، مناسب برای حیوانی است که دچار التهاب و واکنشهای ایمنی مختلف شده است. 7-2-3- اینترلوکین- 6
توسط کیت الیزا ساخت شرکت کوزوبیو کشور چین اندازهگیری شد.
8-2-3- روش آماری
برای تجزیه و تحلیل آماری نتایج بدست آمده در پژوهش حاضر از نرم افزار کامپیوتری SPSS استفاده شد. برای پی بردن به اختلاف آماری معنیداری هر یک از پارامترهای اندازهگیری شده در خون و سرم گوسفندهای آلوده و غیر آلوده از آزمون تی استیودنت 125استفاده گردید. برای پی بردن به اختلاف آماری بین سه گروه آلوده با درصدهای پارازیتمی کم (2)، متوسط (2-4) و زیاد(4) از آزمون oneWay ANOVA ، توکی و دانکن استفاده گردید. برای پی بردن به رابطه پارامترهای اندازهگیری شده در خون وسرم گوسفندهای آلوده به درصدهای مختلف آلودگی از آزمون همبستگی126استفاده گردید. برای پی بردن به این که با افزایش پارازیتمی در گوسفندان آلوده هر پارامتر چه روندی را طی میکند از آزمون رگرسیون استفاده گردید. در بررسی آماری، سطح معنیدار 05/0p در نظر گرفته شده است. داده ها در بخش نتایج به صورت (میانگین انحراف معیار) محاسبه و مقایسه شدند.
«فصل چهار»
« نتایج»
نتایج بدست آمده از بررسی پارامترهای هماتولوژیک ، آنزیم آدنوزین دآمیناز و میانجیهای التهابی در سرم خون گوسفند های مبتلا به تیلریوز ناشی از تیلریا لستوکاردی در جدولهای 1-4 تا 8-4 و نمودارهای 1-4 تا 16-4 ارائه شده است. میزان پارامترهای هماتولوژیک ، پارامترهای التهابی و آنزیم آدنوزین دآمیناز سرم گوسفند های سالم و مبتلا به ترتیب در جدولهای 1-4 و2-4 نشان داده شده است.
گوسفند های سالم و مبتلا به تیلریوز از نظر تعداد گلبولقرمز، میزان هموگلوبین، هماتوکریت،MCV،MCH ،MCHC ، تعداد گلبول های سفید، لنفوسیتها، مونوسیتها، ائوزینوفیلها، آدنوزین دآمیناز، IL1 ، IL6 ، TNF و IFN دارای اختلاف آماری معنی داری بودند((05/0p).میزان گلبولهای قرمز، هموگلوبین ، هماتوکریت و MCHC خون در گوسفند های مبتلا به طور معنی داری کمتر از گوسفند های سالم بود (05/0p) و برعکس ، تعداد گلبول های سفید ، میزان لنفوسیت ها، مونوسیت ها، ائوزینوفیل ها،MCH، MCV، آدنوزین دآمیناز، IL1 ، IL6 ، TNF و IFN در گوسفند های مبتلا به تیلریوز به طور معنی داری بیشتر از گوسفند های سالم بود (05/0p). ( جدولهای شماره 1-4 و2-4 )
میزان پارامترهای هماتولوژیک ، پارامترهای آنزیمی و میانجی های التهابی سرم خون گوسفند های مبتلا به تیلریوز با درصدهای مختلف پارازیتمی به ترتیب در جدولهای 3-4 و 4-4 نشان داده شده است. نتایج نشان میدهد که تفاوت آماری معنی داری میان گروه سالم و گروههای با درصدهای مختلف پارازیتمی وجود دارد (05/0p). میزان گلبولهای قرمز، هموگلوبین، هماتوکریت،MCV،MCH ،MCHC، تعداد گلبول های سفید، لنفوسیت ها، مونوسیت ها، ائوزینوفیل ها، آدنوزین دیآمیناز، IL1 ، IL6 ، TNF وIFN در گروههای با درصدهای پارازیتمی مختلف، دارای اختلاف آماری معنی داری بود (05/0p).
نتایج نشان داد که با افزایش پارازیتمی در گوسفند های مبتلا به تیلریوز میزان گلبولهای قرمز، هموگلوبین و هماتوکریت کاهش معنی داری داشته است (05/0p). برعکس ، با افزایش پارازیتمی ، میزان لنفوسیت، مونوسیت وائوزینوفیل افزایش معنی داری نشان داد. اما میزان آدنوزین دیآمیناز، IL1 ، IL6 ، TNF وIFN با افزایش پارازیتمی تغییر معنیداری نشان نداد(05/0p).(جدولهای 3-4 و4-4)
همبستگی میان درصد پارازیتمی با گلبولهای قرمز، هموگلوبین، هماتوکریت، MCV، MCH، MCHC، گلبولهای سفید، لنفوسیت، نوتروفیل، مونوسیت، ائوزینوفیل، آدنوزین دآمیناز، IL1 ، IL6 ، TNF و IFN در گوسفند های مبتلا به تیلریوز به ترتیب در نمودارهای 1-4 تا 16-4 نشان داده شده است.
میزان همبستگی میان پارامترهای هماتولوژیک ، آدنوزین دآمیناز و میانجیهای التهابی سرم خون گوسفندهای آلوده به تیلریوز در جدول شمار 5-4 نشان داد که همبستگی آماری معنی داری میان MCV و IL6(449/0=r و 01/0p)،MCHC و IL6(391/0r= و 05/0p)و گلبول های سفید و (344/0=r و 05/0p)وجود دارد. (جدول شماره 5-4)
نتایج بدست آمده از میزان همبستگی میان پارامترهای هماتولوژیک ، از پارامترهای التهابی و آدنوزین دآمیناز در سرم خون گوسفندهای مبتلا به تیلریوز با میزان پارازیتمی بین 0-2 درصد در جدول شماره6-4 نشان میدهد که همبستگی آماری معنی داری میان گلبول های سفید و آدنوزین دآمیناز (625/0r= و 05/0p)، نوتروفیل و IL1 (681/0=r و 05/0p) ، IL1 وIL6(623/.r= و05/0p)و IFN(696/ 0=r و 01/0p)، TNFو IFN(688/0=r و 05/0p)وجود دارد ولی میان سایر پارامترها همبستگی معنی داری وجود ندارد. (جدول شماره 6-4)
نتایج بدست آمده از میزان همبستگی میان پارامترهای هماتولوژیک ، پارامترهای التها بی و آدنوزین دآمیناز در سرم خون گوسفندهای مبتلا به تیلریوز با میزان پارازیتمی بین 2-4 درصد در جدول شماره 7-4 نشان میدهد که همبستگی آماری معنی داری میان هماتوکریت و IL1(615/0=r و 05/0p)، MCHC و IFN(622/0=r و 05/0p)، نوتروفیل و آدنوزین دآمیناز (581/0=r و 05/0p) وجود دارد ولی میان سایر پارامترها همبستگی معنی داری مشاهده نشد. (جدول شماره 7-4)
نتایج بدست آمده از میزان همبستگی میان پارامترهای هماتولوژیک ، پارامترهای التهابی وآدنوزین دآمیناز درسرم خون گوسفندهای مبتلا به تیلریوز با میزان پارازیتمی بیشتر از4 درصد درجدول شماره8-4 نشان میدهد که همبستگی آماری معنیداری میان گلبول قرمزوIL6 (815/0=r و 01/0p)،هماتوکریت و آدنوزین دآمیناز(646/0r= و 05/0p)،MCV و IL6(788/0=r و 05/0p) ،MCH و TNF(795/0=r و 01/0p)، نوتروفیلو آدنوزین دآمیناز (660/0=r و 05/0p)، IL6 و IFN(757/0=r و 05/0p)وجود دارد ولی میان سایر پارامترها همبستگی معنی داری مشاهده نشد.(جدول شماره 8-4)
جدول (1-4) ـ میزان(میانگین انحراف معیار) پارامترهای هماتولوژیک خون گوسفند های غیر آلوده و آلوده به تیلریوز Band (×〖10〗^3/μl) Eosi (×〖10〗^3/μl) Mono (×〖10〗^3/μl) Neut (×〖10〗^3/μl) Lym (×〖10〗^3/μl) WBC (×〖10〗^3/μL) MCHC (%) MCH (pg) MCV (fl) PCV (%) Hb (g/dl) RBC (×〖10〗^6/μl) Prasitemia (%) تعداد
پارامتر
گروه 0 a
±0
a
12/0 01/0±
a
20/0 01/0±
a
45/2 14/0±
A
76/7 12/0±
A
55/10 18/0±
a
70/35 43/0±
a
56/11 15/0±
a
42/32 43/0±
a
60/33 34/0±
A
05/12 07/0±
a
43/10 12/0± 0 ±0
15
غیرآلوده 0 a

b
30/0 04/0±
b
43/0 05/0±
a
66/2 04/0±
B
49/9 14/0±
B
97/12 18/0±
b
77/32 42/0±
b
56/12 13/0±
b
49/38 48/0±
b
46/25 99/0±
B
27/8 29/0±
b
61/6 25/0± 30/3 27/0±
34 آلوده در هر ستون حروف لاتین نامتشابه نشان دهندهی اختلاف آماری معنی دار میان دو گروه غیرآلوده و آلوده با 05/0p میباشد.
جدول (2-4) ـ میزان (میانگین انحراف معیار) آدنوزین دآمیناز و میانجیهای التهابی در سرم خون گوسفندان غیرآلوده و آلوده به تیلریوز پارامتر گروه
تعداد Adenosine
deaminase u/l IL1
ng/ml IL6
pg/ml TNF
ng/ml
IFN
pg/dl
غیرآلوده
15
a
67/6 63/0±
a
21/0 0±
A
00/58 0±
A
74/0 03/0±
a
42/12 22/0±
]]>