منبع پایان نامه درباره نرم افزار، تکنولوژی

سپس 35 چرخه شامل دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سانتی گراد 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه اعمال گردید. در انتها 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا تکثیر قطعات تکمیل گردد. دستگاه PCR مورد استفاده در این آزمایش مدل ABI Vertri 96 بوده است. ABI Vertri 96 Thermal CyclerABI Vertri 96 Thermal Cycler ABI Vertri 96 Therm
جدول 2-2 مواد مورد نیاز برای واکنش PCR
مواد مورد نیاز PCR
میزان مواد مورد نیاز (میکرولیتر)
DNA
1
بافر
ا
dNTPs
1 میکرولیتر
پرایمر فوروارد
5/0 (غلظت 5 پیکومول)
پرایمر ریورس
5/0 (غلظت 5 پیکومول)
آنزیم تک پلیمراز
1/0
MgCl2
6/0
آب مقطر
3/5
حجم نهایی
10
2-9 آزمون کارآیی پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن تنوع تک نوکلئوتیدی
برای آزمون قابلیت پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن های مورد مطالعه، قطعات ژنی مورد نظر در تعداد محدودی ژنوتیپ (4 ژنوتیپ) تکثیر شده و سپس وجود تنوع تک نوکلئوتیدی در این قطعات از طریق توالییابی مورد بررسی قرار گرفت. برای اطمینان کامل از نتایج توالییابی، هر دو پرایمر فوروارد و ریورس در واکنشهای جداگانه برای تکثیر یک قطعه مورد نظر و سپس توالی یابی آن قطعه استفاده شدند. در نهایت، نتایج این توالی ها با توالی اصلی ژن که در GeneBank گزارش شده (توالی هایی که پرایمرها از روی آنها طراحی شدند)، مقایسه گردیدند. توالی یابی به کمک دستگاه ABI 3100 انجام گرفته است. قطعات ژنی تکثیر شده توسط پرایمرها، روی ژل آگارز 2/1 درصد تست گردیدند. شکل 2-10 محصول PCR چهار ژنوتیپ که هر یک با 5 پرایمر روی ژل آگارز مورد آزمایش قرار گرفتهاند را نشان میدهد.
226 /21 جفت باز
148/5 جفت باز
027/2 جفت
564جفت باز
226 /21 جفت باز
148/5 جفت باز
027/2 جفت باز
564 جفت باز
2-10 واکنش توالییابی
برای انجام توالییابی، محصولات PCR با کیفیت بسیار بالا و فاقد قطعات غیر اختصاصی ژن مورد نظر نیاز میباشد. این واکنش شامل مراحل زیر بوده است:
1- در مرحله اول، واکنش PCR برای نمونههای گیاهی انجام گرفته و محصولات حاصل روی ژل آگارز تست شدند. بعد از اطمینان از تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر و فقدان هر گونه باند اضافی روی ژل، این محصولات برای مرحله بعدی آماده شدند.
2- در مرحله دوم، برای هر محصول PCR که در مرحله قبل تهیه شده بود دو واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام گرفت. یک واکنش PCR با پرایمر فوروارد و دیگری با پرایمر ریورس. زیرا در این مرحله هدف از انجام این واکنش تولید تعداد زیادی محصول PCR تک رشتهای است. مواد مورد نیاز برای این واکنش PCR در جدول 2-3 آمده است. شرایط PCR در این مرحله شامل یک چرخه دمائی 96 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، سپس 25 چرخه دمایی شامل دمای 96 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه، دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 5 ثانیه و دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه و یک چرخه انتهائی با دمای 4 درجه سانتیگراد بوده است.
3- مرحله سوم خالص سازی محصولات PCR است. مراحل خالص سازی به شرح زیر میباشد.
ابتدا 10 میکرولیتر محصول PCR با 40 میکرولیتر آب مقطر، 150 میکرولیتر الکل مطلق و 5 میکرولیتر استات سدیم 3 مولار مخلوط شده و به مدت 6-5 دقیقه تکان داده شده، سپس به مدت 15 دقیقه در فریزر قرار داده شدند. پس از آن، به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ با دور 8000 دور در دقیقه قرار گرفتند. بعد از آن، محلول موجود در داخل تیوبها خارج شده و تیوبها به حالت معکوس روی یک سطح تمیز قرار داده شدند تا کاملاً خشک شوند. سپس 200- 150 میکرولیتر الکل 75% به هر تیوب اضافه گردید تا شستشو انجام گیرد. تیوبها برای مدت کوتاهی با دست تکان داده شده و مجدداً به مدت 10 دقیق در سانتریفیوژ 10000 دور در دقیقه قرار داده شدند. پس از آن، محلول موجود در تیوبها خارج شده و در دستگاه خشک کن قرار داده شدند. پس از خشک شدن کامل تیوبها، به هر یک از آنها 5/6 میکرولیتر فرمامید به عنوان بافر اضافه گردید و تیوب ها با دور 600-500 دور اسپین شدند تا رسوب موجود در ته ظرف با بافر کاملاً مخلوط گردد.
4- در مرحله چهارم محصولات PCR خالص سازی شده برای دِنیچره شدن به مدت 5-4 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر با دمای 94 درجه سانتیگراد قرار داده شده و بلافاصله پس از خارج کردن از دستگاه روی یخ قرار گرفتند تا از رِنیچره شدن آنها جلوگیری شود.
5- در مرحله آخر، محصولات PCR دِنیچره شده برای توالییابی در دستگاه ABI3100 (شکل 2- 11) قرار داده شدند. شکل 2- 12 نمونهای از کروماتوگرام نمونههای توالی یابی شده در دستگاه AB3100 را نشان میدهد.
جدول 2-3 مواد مورد نیاز برای انجام دومین واکنش PCR در توالییابی
مواد مورد نیاز
میزان مواد مورد نیاز (میکرولیتر)
کیت* توالییابی
4
محصول PCR
1
آب مقطر
4
پرایمر (فوروارد یا ریورس)
1
حجم نهایی
10
* کیت توالییابی شامل بافر PCR، dNTP برچسب دار و آنزیم تک پلیمراز است.
پس از انجام مراحل فوق و آزمون کارآئی پرایمرها در تعداد محدودی ژنوتیپ، اطمینان حاصل گردید که پرایمرهای طراحی شده در این مطالعه (برای دو ژن CBL4 و vHKT1) از قابلیت بالایی برای بررسی تنوع تک نوکلئوتیدی در بقیه ژنوتیپها نیز برخوردارند. نتایج مرحله اول آزمایش در مقیاس کوچک علاوه بر نشان دادن قابلیت بالای پرایمرها، کارائی و دقت بسیار زیاد روش توالییابی در مقایسه با روشهای رایج دیگر برای مطالعه پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی را نیز نشان داده است. ضمن آنکه با استفاده از این روش و بهرهمندی از ابزار و تکنولوژیهای قوی توالییابی در حال حاضر در زمان و هزینه مورد نیاز برای چنین مطالعاتی نیز صرفه جوئی میگردد. بنابراین، کلیه نمونههای گیاهی (96 ژنوتیپ) در این آزمایش با روش توالییابی مورد بررسی و آنالیز ژنتیکی قرار گرفتند.
2-11 آنالیز ژنتیکی دادههای توالییابی
آنالیز دادههای توالییابی با استفاده از نرمافزارهای CodonCodeAligner، DNASTAR و HaploSNPer انجام گرفته است. از نرمافزارهای DNASTAR و CodonCodeAligner برای ترکیب توالیها و یافتن انواع موتاسیونهای تک نوکلئوتیدی، رسم درخت فیلوژنی و نقشههای هضم آنزیمی استفاده گردید (Kapustin et al., 2008). جستجو و تشخیص گروههای هاپلوتیپی به کمک نرمافزار HaploSNPer انجام گرفت.
فصل سوم- نتایج و بحث
تشخیص و تعیین تعداد، انواع و محل وقوع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در دو ژن مورد مطالعه در این تحقیق (HKT1 و CBL4) به کمک آنالیز نتایج توالییابی قطعات تکثیری این ژنها انجام گرفته است. این آنالیز به دو شکل صورت گرفته است. در حالت اول، توالی نوکلئوتیدی چهار قطعه هم پوشان حاصل از تکثیر چهار پرایمر از هر ژن در هر ژنوتیپ به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با یکدیگر ترکیب شده و یک قطعه ترکیبی7 که شامل توالی کامل بخش بیان شده این ژن بود، به دست آمد. پس از آن، این قطعات ترکیبی در 96 ژنوتیپ مورد مطالعه با توالی بیان شده ژن در رقم شاهد که از آن برای طراحی پرایمر استفاده گردید مقایسه شدند. این مقایسه نیز به کمک نرم افزار CodonCode Aligner انجام گرفته است. در حالت دوم، توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیر شده توسط هر پرایمر در 96 ژنوتیپ آزمایشی همراه با قطعه مربوط در شاهد به کمک نرم افزار فوق با یکدیگر مقایسه گردیدند. این نرم افزار با مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژنوتیپهای مختلف و شاهد، انواع موتاسیونها شامل حذف و اضافه نوکلئوتیدی، جابجائیهای نوکلئوتیدی، همچنین هموزیگوت و یا هتروزیگوت بودن موتاسیون و محل وقوع آنها را مشخص نموده است.
3- 1 آنالیز قطعه کامل ژن HKT1
توالی ژنومی قطعه مورد نظر ژن HKT1، که به عنوان یکی از ژنهای متحمل به شوری در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است، به طول bp 1925 بوده که قسمت بیان شده آن (بخش رنگی) به طول bp 1540 و به صورت یک کانتیگ یکپارچه از مناطق اگزونی میباشد (شکل 3- 1). قطعه ژنومی کامل بیان شده ژن HKT در کلیه ژنوتیپهای آزمایشی تکثیر شده و سپس توالییابی گردید و به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با شاهد مقایسه شده است. نتایج این آنالیز در جدول 3- 1 ارائه گردیده است. در این جدول، تعداد کل بازها (نوکلئوتیدها)ی متعلق به قطعه ژنی مورد نظر در 96 ژنوتیپ آزمایشی 224258 باز گزارش شده است که با مقایسه آنها با یکدیگر مشخص گردید 4021 باز از آن نسبت به شاهد تغییر یافته و موتانت شدهاند. این تعداد تغییرات در 1575 مکان ژنی اتفاق افتاده است. با مقایسه تعداد بازهای موتانت و تعداد مکانهای ژنی که در آن موتاسیون رخ داده میتوان نتیجه گیری نمود که در یک مکان ژنی، بیش از یک نوع موتاسیون در ژنوتیپهای مختلف به وقوع پیوسته است. مطابق نتایج جدول فوق در 167 مورد، وقوع موتاسیون موجب قرار گیری دو نوکلئوتید متفاوت در مجاورت هم گردیده که اصطلاحاً گفته میشود موتاسیون نوع هتروزیگوس اتفاق افتاده است. در 2554 مورد، عکس حالت قبل رخ داده و قرارگیری دو نوکلئوتید مشابه در مجاورت یکدیگر موجب ایجاد موتاسیون نوع هموزیگوس شده است. تعداد 355 موتاسیون از مجموع 2554 موتاسیون هموزیگوس در منطقه کد کننده ژن قرار گرفته است.
1 tcgcactcat atatagcacc atgggttggg tgaaaagatt ttaccaagat ttcatccata
61 tcaagctgca tagcttttgc cgtatcagta gatatgttgt cgattcaata gcttttgtct
121 atcgatttgt tgcattgcat gttcacccct tctggatcca actgtcctac ttccttgcca
181 ttgctatact tggttcagtc ctcttgatgt cgctgaaacc aagcaacccc gacttcagcc
241 ctccttacat tgacatgtta ttcttgtcaa cttctgctct aacagtttct ggcctcagca
301 ccatcacgat ggaggacctc tcaagcgctc aaattgtggt cttgacactg ctcatgcttg
361 taggagggga gatctttgtt tcactcttag ggctcatgct tagagtgaac catcaagaca
421 tgccagatct tccaagagtg aagatcagct cagttcctgt cgagcttgaa gagatagact
481 tggccaacag catggcactc tctgatgagt cacagcttga agaagcaact catgcaatta
541 cacccaagaa atgtacaggg ttgaagagga gtaggtctgt caagtgctta ggatatgtgg
601 tctttgggta ctttgccgtg atccatatct tgggctttct gctggttttt ctgtatataa
661 ctcgtgtgcc aactgcaagt gcaccactca acaagaaagg gatcaacatt gtgctcttct
721 cattatcggt taccgtcgcc tccattgcaa atggaggact cgtgccgacg aatgagaaca
781 tggtcatctt

مطلب مرتبط با این موضوع :  مقاله رایگان درموردسلسله مراتب

دیدگاهتان را بنویسید